Plos Pathogens︱河南农业大学刘慧敏/陈陆团队揭示游离态ISG15抑制PRV复制的分子机制
撰文︱刘慧敏，陈 陆
责编︱王思珍，方以一
编辑︱杨彬薇干扰素刺激基因15（Interferon-stimulated gene 15，ISG15）是I型IFN诱导的类泛素蛋白，通过以游离态（胞内、胞外）或共价修饰（ISGylation）两种形态存在。近年来，ISG15在病毒感染中的作用备受关注，多项研究发现ISG15发挥抗病毒或原病毒的作用依赖于病毒和宿主的种类。然而，ISG15在病毒复制中的作用仍然备受争议。小鼠细胞的体外研究发现ISG15在某些病毒感染中发挥抗病毒作用，但是有些研究发现敲除ISG15并没有增强病毒复制。在人细胞实验中发现敲减ISG15具有抑制多种病毒复制的作用，而另外一些实验却发现ISG15却没有这个作用。另外，学者发现ISG15敲除小鼠对某些病毒的易感性增强，而缺乏ISG15的人却表现出增强病毒的抵抗力。更重要的是，有研究发现ISG15通过负调控I型IFN型号通路发挥免疫调节作用[1]。
伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）属于α疱疹病毒，感染宿主广，猪是其自然感染宿主。值得关注的是，最新研究发现感染PRV的患者出现严重脑炎的症状，引起人们对PRV跨种传播的关注[2]。同其他疱疹病毒一样，PRV可在体内建立潜伏感染，尽管目前对PRV有大量研究，但目前尚无有效的治疗方法和疫苗以有效控制PRV。因此，了解PRV与宿主的互作对PRV的有效防控提供基础。2018年河南农业大学的刘慧敏副教授和陈陆教授课题组研究发现，在PRV感染过程中，猪源ISG15的表达显著上调，通过构建ISG15过表达细胞系发现过表达ISG15显著抑制PRV复制，而敲低ISG15能促进PRV复制[3]。但是，ISG15抑制PRV复制的分子机制尚不清楚。此外，ISG15通常以游离态和结合态（ISG15 / ISGylation）存在，那么在PRV复制过程中，ISG15以哪种形态发挥主要抗病毒作用也不清楚。
2022年11月10日，河南农业大学刘慧敏副教授和陈陆教授课题组在Plos Pathogens上在线发表了题为“Free ISG15 inhibits Pseudorabies virus infection by positively regulating type I IFN signaling”的研究。该研究基于前期研究的基础上，通过结合抑制实验发现ISG15通过游离态的形式抑制PRV的病毒释放，进而抑制PRV的复制。在分子水平上，ISG15通过与STAT2的相互作用促进STAT1和STAT2的激活和核定位，进而促进I型IFN介导的抗病毒活动。重要的是，ISG15敲除小鼠表现出对PRV更强的敏感性。该研究通过体外和体内试验证实了ISG15在抗病毒效应及控制病毒感染中的重要性。
尽管作者前期研究发现在PRV感染中ISG15的表达明显上调，但是在PRV感染过程中，ISG15/ISGylation蛋白的表达水平的变化尚不清楚。本研究通过分析不同MOI的PRV感染后不同时间点ISG15/ISGylation的表达水平，结果发现在低MOI感染时可诱导ISG15/ISGylation的表达，但是在高MOI 时ISG15/ISGylation的表达被抑制。进一步研究发现PRV的gE蛋白过表达可抑制游离态ISG15的表达，对ISGylation蛋白的表达却没有影响（图1），证实PRV的基因表达是诱导游离态ISG15所必需的。进一步研究发现游离态ISG15可以通过抑制病毒释放而抑制PRV的复制。
图1. Time course of ISG15 and ISGylation expression during PRV infection.
（图源：Liu，et al., Plos Pathogens, 2022）
与其他α疱疹病毒相似，PRV能通过抑制I型IFN信号而在宿主体内建立潜伏感染。为分析游离态ISG15是否参与I型IFN的抗病毒活性，通过ISG15敲除细胞系的回补实验和ISG15的过表达分析，结果表明ISG15能促进PRV诱导的I型IFN的产生和释放，进而抑制PRV复制，另外，敲除ISG15能抑制IFNα介导的抗病毒活性。作者进一步发现，敲除ISG15阻断内源性STAT1和STAT2的磷酸化，而不依赖于IFNα的处理。STAT1/STAT2发生磷酸化后形成STAT1/STAT2异源二聚体，作者通过Co-IP实验发现敲除ISG15抑制STAT1/STAT2二聚体的形成。以上结果说明游离态ISG15可促进STAT1/STAT2的磷酸化和二聚体的形成（图2）。
图2. Knockout of ISG15 prevents the activation of STAT1 and STAT2.
（图源：Liu，et al., Plos Pathogens, 2022）
激活的STAT1/STAT2形成二聚体后与IRF9形成STAT1/STAT2/IRF9 (ISGF3)复合体，进入细胞核启动干扰素刺激应答元件（IFN-stimulated response element, ISRE）的转录，以促进干扰素刺激基因ISGs的表达，参与机体的抗病毒免疫反应。研究人员深入研究发现，ISG15仅通过与STAT2的互作以促进STAT1/STAT2的磷酸化和二聚体的形成，而非STAT1。通过激光共聚焦和Co-IP进一步发现敲除ISG15阻断STAT1/STAT2的核定位，进而抑制ISGF3诱导的ISRE的激活。以上结果证实在I型IFN通路中ISG15发挥正反馈的作用，通过ISG15与STAT2的互作促进STAT1/STAT2的激活，ISGF3的形成，进而促进ISGF3诱导的ISRE的激活，以发挥游离态ISG15抗病毒效应（图3）。
图3. ISG15 facilitates activation of STAT1/STAT2 mainly through STAT2.
（图源：Liu，et al., Plos Pathogens, 2022）
最后作者利用ISG15敲除小鼠模型进一步探究了ISG15对PRV复制的抑制作用。作者发现敲除ISG15会增加小鼠对PRV感染的敏感性，加重小鼠的脑炎和肺炎症状，以及更高的炎症因子（图4）。体内实验结果进一步证实了ISG15的抗病毒作用。
图4. PRV challenge assay in vivo.
（图源：Liu，et al., Plos Pathogens, 2022）
原文链接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1010921
河南农业大学生命科学学院刘慧敏副教授为本文的第一作者，河南农业大学动物医学院陈陆教授和常洪涛副教授为本文的通讯作者，课题组李琛、何文峰、陈静和杨国庆也参与部分工作。本研究得到国家自然基因（31902268和31772781）和河南省青年骨干教师项目（2021GGJS034）的资助。
第一作者：刘慧敏（左）；通讯作者：陈陆（中），常洪涛（右）
（照片提供自：刘慧敏/陈陆/常洪涛团队）
常洪涛，男，博士，副教授。河南省教学标兵、全国高校教师教学竞赛河南省一等奖、河南省科学技术进步一等奖。主要研究方向为猪传染病联合免疫防控。
群备注格式：姓名-单位-研究领域-学位/职称/称号/职位
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[1] Perng YC, Lenschow DJ. ISG15 in antiviral immunity and beyond. Nat Rev Microbiol. 2018; 16(7):423–39. Epub 2018/05/18. https://doi.org/10.1038/s41579-018-0020-5.
[2] Liu Q, Wang X, Xie C, Ding S, Yang H, Guo S, et al. A Novel Human Acute Encephalitis Caused by Pseudorabies Virus Variant Strain. Clin Infect Dis. 2021; 73(11): e3690–e700. Epub 2020/07/16. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa987.
[3] Liu H, Li S, Yang X, Wang X, Li Y, Wang C, et al. Porcine ISG15 modulates the antiviral response during pseudorabies virus replication. Gene. 2018; 679:212–8.
本文完